Por aquel entonces, el Rey Enrique IV había tenido una hija, Juana de Castilla, más conocida como Juana la Beltraneja, con la heredera portuguesa, Juana. Muchos nobles se opusieron a aceptarla como heredera dadas las sospechas de que era hija ilegítima del Duque de Alburquerque, Beltrán de la Cueva, y propusieron a Alfonso como heredero al trono.
Sin embargo éste murió en 1468, por lo que los nobles opositores a Enrique IV, la designaron a ella para ocupara al trono. Isabel no accedió a ello, por respeto al rey, que era además su hermanastro, pero consiguió ser proclamada Princesa de Asturias el 19 de septiembre de ese mismo año, en la ceremonia de los Toros de Guisando, y por tanto, optar al trono a la muerte de Enrique IV.
El rey, que veía en Isabel una rival formidable, siguió tratando de casarla con candidatos que le dejasen a su hija Juana libertad para finalmente acceder a la Corona de Castilla, pero Isabel se siguió negando y negoció en secreto con Juan II de Aragón, su matrimonio con Fernando, su hijo, a pesar del impedimento legal por ser primos segundos. Las capitulaciones matrimoniales se firmaron en Cervera el 5 de marzo de 1469, tras falsificar una bula papal de Pío II. Finalmente, el 19 de octubre contrajeron matrimonio en Valladolid, y 2 años después, obtuvieron la dispensa papal de la mano de Sixto IV.
El 13 de diciembre de 1474, 2 días después de la muerte de su hermanastro Enrique IV, fue proclamada reina de Castilla, en cumplimento del acuerdo de los Toros de Guisando. Pocas semanas después estalló la Guerra de Sucesión Castellana, donde Isabel y sus partidarios castellanos, apoyados por la Corona de Aragón, se enfrentaron a los partidarios de Juana, respaldados por Portugal y Francia. Rápidamente Isabel se impuso en Castilla, desplazándose el conflicto a Portugal, que se resolvió finalmente con la firma del Tratado de Alcaçovas, reconociendo a Isabel y Fernando como reyes castellanos.
Isabel fue una reina enérgica y decidida, siempre presente en el campo de batalla y allá donde se le necesitase. Prueba de ello fueron su presencia en todas las batallas libradas, siempre acompañada de sus hijos en la retaguardia, prestando cuantos servicios necesitasen sus tropas. En la rendición de Baza, Isabel jugó un papel clave; su presencia en el frente, acompañada de su hija Isabel, y su arenga a las tropas, levantaron la moral de éstas y acabaron por minar el ánimo de los sitiados, que presentaron su rendición solo ante la propia reina.
Otra prueba de su valor fue el comportamiento durante la revuelta segoviana que amenazaba con tomar el Alcázar, donde se encontraba su primogénita, debido a que ésta estaba al cuidado de un matrimonio de origen judío. Isabel, que se encontraba a más de 50 kilómetros de allí, partió rápidamente acompañada de apenas 3 guardias y cuando llegó el Alcázar, se dirigió personalmente a la multitud y escuchó una a una las peticiones de la gente. Los segovianos le juraron fidelidad a pesar de seguir confiando la educación de su hija al mismo matrimonio.
A Isabel de Castilla le debemos la creación de los hospitales de campaña. Su presencia permanente en el campo de batalla, le llevó a acompañarse de multitud de médicos y cuidadores para atender a los heridos, creando instalaciones especialmente dedicadas a ese fin en la retaguardia, reduciendo así el número de bajas entre sus tropas. Siempre interesada en los asuntos militares, tuvo en Gonzalo Fernández de Córdoba, conocido como el Gran Capitán, a su hombre más preciado y distinguido, fiel a sus servicios desde los tiempos de la Guerra de Sucesión Castellana, destacándose definitivamente en la toma de Granada.
Su carácter curioso y arriesgado le llevó a apostar decididamente por la propuesta de Cristóbal Colón. Se opuso a la esclavización de los indígenas y dictó las primeras normas otorgando derechos a éstos, algo inédito en Europa, y que darían lugar posteriormente a las Reales Ordenanzas y a las Leyes de Burgos. También decretó la creación de un cuerpo policial para evitar el bandidaje y hacer más seguro el comercio, la Santa Hermandad, a petición de los concejos municipales.
En 1494 firmó con Portugal el Tratado de Tordesillas, marcando los límites de influencia de España y Portugal en el Atlántico. En 1496 el papa Alejandro VI concedió a Isabel y Fernando el título de Reyes Católicos, mediante la bula “Si Convenit”, que quedaría en herencia para sus sucesores. También concedería a Isabel, en 1500, el título de Rosa de Oro de la Cristiandad.
Falleció el 26 de noviembre de 1504, en el Palacio Real de Medina del Campo, tras llevar tiempo sumida en una profunda depresión por su enfrentamiento con su hija Juana y ver cómo morían su madre, su primogénita, su único hijo varón y su nieto, Miguel, que estaba llamado a unir las coronas española y portuguesa. En su testamento dejó escrito, según registros del político Diego Clemencín y Viñas: “Mi cuerpo sea sepultado en el monasterio de S. Francisco que es en el Alhambra de la ciudad de Granada (...) en una sepultura baja que no tenga bulto alguno, salvo una losa baja en el suelo, llana, con sus letras en ella. Pero quiero e mando, que si el Rei eligiere sepultura en otra cualquier iglesia o monasterio de cualquier otra parte o lugar destos mis reinos, que mi cuerpo sea allí trasladado e sepultado junto.”
Es en la Capilla Real de Granada donde yacen sus restos, junto a los de su marido, Fernando, su nieto y su hija Juana y el marido de ésta, Felipe el Hermoso, además de su propia corona y el cetro real.
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